分子生物學筆記 第三章 基因表達的調控

第三章 基因表達的調控 基因表達：DNA→mRNA→蛋白質的遺傳信息傳遞過程基因表達的調控 第一節(jié) 基因的活化 基因的“開關”-染色質的活化一、活性染色質的結構間期核染色質：異染色質(heterochromatin)，高度壓縮(不轉 錄)；常染色質(euchromatin)，較為松散， 常染色質中約10%為活性染色質(更開放疏松)?；钚匀旧|→←非活性染色質二、活性染色質的結構特點 (一)DNaseI敏感性 轉錄活性(或有潛在轉錄活性)的染色質對DNase I更敏感． DNase I超敏感位點(DNase I HyperSensitive Sites，DHSS) (二)組蛋白H3的CyS110上巰基暴露，三、活性染色質結構的形成（一)、核小體位相(Phased positioning) 1．核小體的旋轉定位(rotational positioning) 指核小體核心與DNA雙螺旋在空間結構中的相互關系，主要包括DNA雙螺旋的大溝是面向還是背向核心結構． ‘ 2．核小體的平移定位(translational positioning) 指核小體與特定DNA序列的結合位置和方式，特別是轉錄活性相關的DNA調控元件（啟動子、增強子等）序列與核小體的相互位置關 系。 (二)、組蛋白修飾 1．H1組蛋白磷酸化促進染色體包裝，影響轉錄活性， 2．核心組蛋白修飾乙?；撼０l(fā)生在組蛋白的Lys，一般活性染色質是高度乙?；?。（三)HMG蛋白結合 HMG（high mobility group)蛋白―高遷移率蛋白, 如HMG14/HMG17. 與核小體核心顆粒結合，有利轉錄。四、DNA甲基化與基因表達 ． (一)、真核生物基因組DNA的甲基化(Methylation) 哺乳動物基因組中5%的C為甲基化(m C)，mC主要存在于CpG二核苷酸中． CpG二核苷酸序列常成簇聚集并零散地分布于人基因組中，形成CpG島(CpG islands)．人基因組中約每10Kb就有一個CpG島． CpG島常與基因相連(可作為尋找基因的標記)。 (二)DNA甲基化的轉錄抑制作用。基因表達與甲基化呈負相關基因甲基化狀態(tài)： 1、高度甲基化： 基因為持續(xù)失活(如女性的一條X染色體； 2、誘導去甲基化：如組織或發(fā)育階段特異性表達基因； 3、持續(xù)低水平甲基化：具有轉錄活性(如持家基因)。持家基因(housekeeping gene)： 是指對所有類型組織細胞在任何時候都需要其表達的基因，通常都是維持細胞基本生存所必須的基因，其表達常保持在固定的水平。又稱 為組成性基因(Constitutive gene)。（三）甲基化與基因組印跡基因組印跡(genomic imprinting)：指基因表達活性只局限于來自雙親之一的基因版本。被印跡(imprinted)的基因．基因組印跡的機 制--DNA高度甲基化基因組印記與腫瘤． 第二節(jié) 轉錄水平的調控轉錄水平的調控是基因表達調控中最重要的環(huán)節(jié)。一、真核基因轉錄基本條件：特異性基因轉錄的基本條件包括： ①啟動子(特別是核心啟動子) ②轉錄模板(轉錄起始點（+1）---終止點) ③RNA PolⅡ ④普通轉錄因子(GTFs) (一)啟動子(promoter) 與基因轉錄啟動有關的一組DNA序列，一般位于RNA poII轉錄起始點上游100-200bp以內，其功能是決定轉錄的起始點和調控轉錄頻率．啟動子區(qū)域包括核心啟動子和啟動子上 游近側序列： 1、核心啟動子(core promoter) 是決定轉錄起始位置的關鍵序列，也是普通轉錄因子TFⅡD的結合位點， ①TATA盒(TATA box) 位于轉錄起始點上游-25～-30bp． ②起始子(initiator，Inr) Inr是與轉錄起始位點重疊的短的較保守序列．注：①不是所有基因都含有TATA盒或Inr序列．有的只有其中之一，有的兩者都 無． ②這些核心啟動子的序列和它們之間的間隔多變 2、上游啟動子元件(Upstream Promoter element，UPE) 位于較上游(-30一-110bp)，能較強影響轉錄起始的頻率，如CAAT 盒和GC盒．其中GC盒是轉錄因子SPl的結合位點。 (二)RNA聚合酶Ⅱ 負責真核生物蛋白編碼基因的轉錄(產物mRNA)，有7-10個亞基，最大亞基的羧基末端結構域(CTD)具有7個氨基酸(Ty r-Ser-Pro-Thr-Ser -Pro-Set)的重復序列，其中有多個磷酸化位點．CTD磷酸化對調控基因轉錄有重要作用． (三)基礎轉錄因子(basal transcription factor) 真核基因轉錄除RNA聚合酶外還需要許多蛋白因子―轉錄因子參加，其中一些轉錄因子是RNA聚合酶Ⅱ轉錄起始必需的，并且可以維 持基礎水平的轉錄，因此稱為基礎轉錄因子或普通轉錄因子(general transcription factor) 1．RNA聚合酶 II的普通轉錄因子(TF II) 包括TFIID,TFⅡB,TFIIF，TFIIE，TFIIH，TFIIA等． TFIID是由TATA盒結合蛋白(TATA binding protein，TBP)和8種TBP協(xié)同因子(TBP associated factor，TAF)組成的復合物，TFIID可識別和結合核心啟動子(TATA盒和Inr)； TFⅡB的C端與TFIID和DNA的復合物結合，N-端與TFⅡF協(xié)同作用募集RNA聚合酶II，再加上TFIIE,TFII H形成完整的轉錄復合物． TFIIH有蛋白激酶活性，可使RNA Pol最大亞基CTD磷酸化，使轉錄起始過渡到轉錄延伸． TFIIA有助于TFIID與TATA盒核心啟動子結合． 2、TAF的作用 TFIID中包括至少8種TBP協(xié)同因子,分子量為30―250kD,分別命名為TAFⅡ-30～250． TAFⅡ150識別起始子(1nr)序列． TAF是基因轉錄調控的輔助因子，它的作用是通過與多種轉錄調控因子（激活物或阻遏物）的轉錄調控結構域結合，而介導轉錄激活或 抑制。二、基因轉錄的順式調控元件順式調控元件(cis-regulating element)是指對基因表達有調控活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處于一個DNA分子上的基因．順式調控元件中的 短核心序列：共有序列或一致序列（consensus sequence)。 (一)啟動子(promoter) (二)增強子(enhancer) 能顯著提高基因轉錄效率的一類順式調控元件（其核心序列常為8-12bp)．增強子的作用特點： 1．能(通過啟動子)提高同一條鏈上的靶基因轉錄速率； 2．增強子對同源基因或異源基因同樣有效； 3．增強子的位置可在基因5’-上游、基因內或3’下游序列中； 4．自身沒有5’-或3’-方向性； 5．增強子可遠離轉錄起始點(最多30Kb)； 6．增強子一般具有組織或細胞特異性． (三)負調控元件―沉寂子 負調控元件是能抑制基因表達的序列．如沉寂子(silencer) (四)其它順式調控元件 1．應答元件(responsive elements) 真核細胞中對某些特定的環(huán)境作出應答的基因，常具有相同的順式元件―應答元件．應答元件能被在一些特定情況下表達的調控因子識別 (又稱為可誘導的順式調控元件／反式作用因子)。 2．轉座元件對基因表達的調控， 。三、基因轉錄的反式作用因子轉錄水平的調控主要是通過與多種DNA元件結合的蛋白因子來實現(xiàn)．反式作用因子(trans-ac ting factor)是通過識別和結合順式調控元件的核心序列而調控靶基因轉錄效率的一組蛋白質．反式作用因子對基因表達的調控可正( 激話)可負(阻遏)． (一)反式作用因子的結構： 結構域(domain)是指蛋白質中可以具有獨立的超二級結構的部分。通常由一個基因外顯子編碼，并可具有特定的功能。在較大的 蛋白質中， 多個結構域間可通過較短的多肽柔性區(qū)互相聯(lián)接．基序(motif)：一般指構成任何一種特征序列的基本結構．作為結構域中的亞單 元，其功能是體現(xiàn)結構域的多種生物學作用． 1．反式作用因子的DNA結合結構域(DNA binding domain)中的幾種常見基序： ①螺旋/轉角/螺旋（Helix-turn-helix,HTH）基序兩段螺旋被一短的轉角結構分開，其中一段螺旋為DNA識別 螺旋．同源異形結構域(Homeodomain，由同源異形盒編碼)中含有HTH基序。具有Homeodomain的轉錄調控蛋 白在胚胎發(fā)育和正常細胞分化的基因表達調節(jié)中有重要作用。 ②鋅指(Zinc finger)基序由肽鏈的保守序列中的一對組氨酸加一對半胱氨酸(His2／Cys2)或2對半胱氨酸(cys2／cys2) 與一個鋅離子形成配位鍵，這些氨基酸對之間的多膚鏈成環(huán)狀突出并折迭成指形結構，多個指結構常串聯(lián)重復。鋅指族轉錄因子以二聚體 形式同DNA上的順式調控元件結合。含鋅指基序的轉錄因子：與GC盒結合的SPl、類固醇激素受體家族，抑癌蛋白WT1等。 ③亮氨酸拉鏈(Leucine-Zipper)基序由一段每隔6個a a 就有一個Leu的伸展肽鏈組成，這些周期性出現(xiàn)的Leu都位于α―螺旋的同―側面，因此兩條均含Leu拉鏈基序的蛋白質通過亮氨 酸側鏈的相互作用形成二聚體。具有亮氨酸拉鏈基序的轉錄因子：原癌基因C-Jun/C-fos(APl家族) ④螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-Helix，HLHt)基序．由2個α螺旋間隔一個非螺旋的環(huán)(loop)組成．如原 癌基因產物C-myc及其結合蛋白Max．含HLH和Leu-拉鏈基序的轉錄因子的相似性： ①均至少含有一個α螺旋，其中都有一側親水面和一側疏水面，因此這兩種基序又稱為兩親α―螺旋基序． ②兩類轉錄因子均依靠α螺旋氨基端附近的堿性區(qū)（帶正電荷aa區(qū)）與DNA結合，因此又分別稱為bzip和bHLH （b=basic，堿性) ③兩類轉錄因子活性都依賴于二聚體化 2、反式激活結構域(Transactivation domain) ‘ 是反式作用因子的轉錄調控結構域，一般由DNA結合結構域外的30-100個aa組成．常見的反式激活域有以下幾種： ①酸性α謹螺旋結構域(acidic a-Helix domain)如Jun； ②富含谷氨酰胺結構域(glutamine―rich domain)如SPl． ⑧富含脯氨酸的結構域(proline-rich domain)。 (二)反式作用因子家族同一類序列特異性轉錄因子一般由基因家族編碼，它們的蛋白結構同源，并結合特異的順式調控元件，這些蛋白 組成一個反式作用因子家族。 1．POU家族這一家族中都有一個獨特的DNA結合結構域-POIJ結構域． POU結構域包括： N端POU特異結構域(POUs)+C端POU同源異形結構域(POUH）． POU結構域是Pit1，octl／oct2和unc86等反式作用因子共有的保守區(qū)，因此這類蛋白統(tǒng)稱為POU結構域蛋白。 2、類固醇激素受體家族包括：糖皮質激素受體(GR），性激素受體(ER／AR)，甲狀素激素受體 (TR)，維甲酸受體(RAR)，VitD3受體(VD3R)．這些受體位于胞質或核內，通過激活基因轉錄起作用．這些受體的D NA結合結構域都含有2個Cys2／Cys2型鋅指基序，(分別由2個外顯子編碼)，可識別DNA上的激素應答元件(HRE：H ormone responsive elements) 3、NF-κB家族 包括RelA(P65)，P60，RelB，C-Rel，P50五種．主要是P50／RelA異二聚體．胞質中P50／RelA •Iκ B抑制蛋白(失活狀態(tài))→釋放Iκ B而被激活→易位至核內→激活轉錄。

 第三節(jié) 轉錄后加工在細胞核內對基因產物(mRNA前體)進行各種修飾、剪接和編輯，使編碼蛋白質的外顯子部分連接成為一個連續(xù)的開放讀 框(open reading frame，ORF)的過程稱為轉錄后加工．一、mRNA前體加工的分子機制 - 核內mRNA前體―異質性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)， hnRNA與蛋白質結合形成核異質性核糖核蛋白(hnRNP), mRNA前體的加工在hnRNP上進行． (一)5’-端加帽(capping) ―mRNA前體的5’-端加甲基化鳥苷(m7pppN) 5’端m7G帽子結構的作用： 1．使mRNA更穩(wěn)定 2．增加蛋白質合成的效率 3．帽子結構對mRNA前體的剪接是必需的（二)3’-端接多聚腺苷(poly(A)) ―在mRNA前體3’端接上一個約200―250個腺嘌呤核苷酸(A)的尾巴。 poly(A)尾巴的作用： 1．有利于mRNA通過核孔； 2．參與穩(wěn)定mRNA； 3．增強翻譯效率。（三)mRNA前體的剪接剪接(sp!icing)―剪除內含子，并將外顯子連接 1．真核內含子的序列特征：真核內含子總是由Gu開始，以AG結束，內含子的5’-端剪接點(供位)和3’-端剪接點(受位)， 以及內含子中的一個內部序列分支點（branch site)是mRNA前體正確剪接所必需的。 2．mRNA前體的剪接機制 -剪接過程由二步連續(xù)的轉酯反應組成．該過程中產生一個套索狀中間體（ lariat intermediate)，結果使2個原先被分隔的外顯子連接。 3．剪接體(spliceosome) 細胞核內的小分子RNA(一般≤300堿基)―SnRNA（small nuclear RNA)，包括U1―U6等。 snRNA與特異的蛋白質形成復合物-SnRNP．mRNA前體與snRNP形成的復合物―剪接體．mRNA前體的剪接通過剪接 體進行。 U2，U6，U4／U6 SnRNP等是活性剪接體的主要成份． (四)RNA編輯(RNA editing) 是一種與mRNA剪接不同的加工方式，指mRNA在轉錄后因插入、缺失或核苷酸的替換，改變了DNA模板來源的遺傳信息，從而翻 譯出氨基酸序列不同的多種蛋白質， RNA編輯的例子：apo―B的編輯：C→U替換。二、內含子的選擇性剪接選擇性剪接(alternative splicing)：在mRNA前體的剪接過程中，參加剪接的外顯子可以不按其線性次序剪接，內含子也可以不被切除而保留，即一 個外顯子或內含子是否出現(xiàn)在成熟mRNA中是可以選擇的，這種剪接方式稱為選擇性剪接。此外，不同的啟動子或不同的poly(A )加尾位點的選擇，也可看作選擇性剪接．選擇性剪接的主要方式。由來自一個基因的mRNA前體因選擇性剪接而產生多種mRNA， 并翻譯出的不同蛋白質，稱為同源異構體(isoform)． >5%的人基因可在不同的組織或生理狀態(tài)下，通過選擇性剪接產生不同的蛋白質異構體，這是造成真接生物高度異質性的基礎。

 第四節(jié) 翻譯水平調控 一、翻譯起始因子(IF)的調節(jié)：可逆磷酸化的作用． 1．eIF-4F的磷酸化激活蛋白質的合成． 2．eIF-2的磷酸化引起翻譯起始受阻，降低蛋白質的生物合成水平二、mRNA結構與翻譯控制 ，（一)5’-UTR結構 1、mRNA5’端m7G帽有增強翻譯水平的作用． 2、“上游AUG密碼子”(位于起始AUG上游的其他AUG密碼子)的存在往往抑制下游開放讀框的翻譯效率． 3、起始AUG旁側序列對翻譯效率的影響．Kozak序列：GCCAUGG (二)3’-UTR結構 1．poly(A)尾增加翻譯效率 2．富含UA序列抑制翻譯。三、mRNA穩(wěn)定性與翻譯控制 mRNA穩(wěn)定性主要取決于3’―UTR結構 1．poly(A)尾增加mRNA穩(wěn)定性， 2．3’-UTR中UA序列導致mRNA不穩(wěn)定．四、翻譯后修飾 1、 氨基酸側鏈的共價修飾：乙?；?、磷酸化、糖基化（N-、O-）； 2、 蛋白質前體的切割和成熟。Proprotein→protein.例：胰島素的成熟。五、蛋白質的分泌和胞內定位信號肽：作為蛋 白質定位信號的短肽序列，指導蛋白質運輸到正確位置，定位結束后通常被特異的信號肽酶切除。常見幾種信號肽的特點： 1內質網和細胞分泌信號：N-端約20個左右氨基酸，疏水。 2 線粒體定位信號：N-端，一面為正電殘基另一面為疏水殘基的兩親α螺旋。 3 核定位信號：內部，常為堿性氨基酸加脯氨酸鏈兩部分構成。如SV40 T 抗原：pro-lys-lys-lys-Arg-lys(127-132)