2017年執(zhí)業(yè)藥師考試藥物分析復習要點第六章色譜法

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　　色譜法是一種物理或物理化學分離分析方法。先將混合物中各組分分離而后逐個分析，是分析混合物最有力的手段。具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快、應用范圍廣等優(yōu)點(環(huán)球網(wǎng)校分享2017年執(zhí)業(yè)藥師考試藥物分析復習要點第六章色譜法)。

　　色譜過程是物質分子在相對運動的兩相(固定相和流動相)間分配平衡的過程，可用分配系數(shù)K和容量因子k描述。

　　例題：色譜過程使物質分子在; A.溶液中達到平衡的過程B. 兩相中平衡的過程C. 固定相中分配的過程 D. 流動相中溶解的過程

　　E. 相對運動的兩相(流動相與固定相)間分配平衡的過程 答案: E

　　1.分配系數(shù)K=Cs/Cm，與組分、固定相和流動相性質和溫度有關。

　　2.容量因子k=Ws/Wm，不僅與組分、固定相和流動相性質和溫度有關，還與兩相體積有關。容量因子不等是色譜分離的先決條件。

　　3.色譜過程方程：保留時間與分配系數(shù)關系tR=t0(1+k)

　　第一節(jié) 薄層色譜法

　　掌握薄層色譜法的基本原理、操作方法以及在藥物鑒別、檢查中的應用。

　　一、基本原理

　　1.吸附薄層色譜：吸附劑對不同組分A和B具有不同吸附能力，展開劑也對A和B有不同溶解、解吸能力，當展開劑不斷展開， A、B在吸附劑和展開劑之間連續(xù)不斷吸附解吸，產(chǎn)生差速遷移得到分離。

　　2.比移值：Rf=l/l0，為組分遷移距離與展開劑遷移距離之比

　　比移值的最佳范圍是0.3～0.5，可用范圍是0.2～0.8。

　　影響比移值因素：①被分離物質的結構和性質。極性較強的組分Rf較小。②薄層板性質。吸附劑活性越強，吸附作用就越強，Rf越小。③展開劑性質。極性越強展開劑Rf值增大④展開劑蒸氣飽和度對Rf也有較大影響。

　　3.分離度：R=2d/(W1+W2)，兩相鄰斑點中心距離與兩斑點平均寬度的比值

　　二、操作方法

　　1.吸附劑和展開劑的選擇

　　(1)吸附劑：常用有硅膠、氧化鋁、聚酰胺、硅藻土等。硅膠、氧化鋁的活性與含水量有關，含水量高，活性低，吸附力弱;聚酰胺表面的酰胺基可形成氫鍵，選擇性高。

　　(2)展開劑：極性較強的展開劑適用于極性較強組分的洗脫;極性較弱的展開劑適用于極性較弱組分的洗脫。加入少量酸、堿可以使極性物質斑點集中，減少拖尾，提高分離度。

　　選擇一般原則是，分離極性較強組分時選用活性低的薄層板，以極性強的展開劑展開。分離弱極性組分時，宜選用活性高的薄層板，以極性弱的展開劑展開。調整待測組分Rf0.3～0.5范圍內(nèi)。

　　2.薄層板制備：1份固定相與3份水混和涂布，110℃烘30分鐘。

　　3.點樣與展開：點樣一般為直徑2～4mm圓點，距底2.0cm;展開距離一般為10～15cm。

　　4.斑點定位：有色可直接觀察;有熒光在紫外燈下觀察;噴灑顯色劑使組分顯色。

　　三、應用 1.鑒別：比較供試品與對照品溶液的比移值 2.雜質檢查：雜質對照品比較法;高低濃度對比法

　　第二節(jié) 氣相色譜法和高效液相色譜法

　　掌握氣相色譜法和高效液相色譜法的基本原理;色譜系統(tǒng)適用性試驗的主要內(nèi)容;氣相色譜法和高效液相色譜法在藥物鑒別、檢查和含量測定中的應用。了解氣相色譜儀和高效液相色譜儀的基本結構。

　　一、氣相色譜法： 以氣體為流動相的色譜法，具有分離效能高、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優(yōu)點，不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質分析。

　　(一)基本原理

　　1.基本概念

　　色譜峰參數(shù)：峰高或峰面積(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰寬(用于衡量柱效)

　　保留值：保留時間、死時間、調整保留時間

　　峰寬：標準差、半峰寬、峰寬

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　　2.塔板理論：把組分在兩相間的連續(xù)轉移過程，分解為間歇的在單個塔板中的分配平衡過程

　　理論塔板數(shù) n=5.54(tR/Wh/2)2

　　色譜柱的理論塔板數(shù)越多，柱效越高;同樣長度中塔板高度越小，柱效越高(環(huán)球網(wǎng)校分享2017年執(zhí)業(yè)藥師考試藥物分析復習要點第六章色譜法)。

　　3.速率理論：主要說明使色譜峰擴張而降低柱效的因素

　　范氏方程 H=A+B/μ+Cμ

　　A為渦流擴散項。采用適當粒度、均勻的填料并填充均勻可減小渦流擴散，開管毛細管柱A=0

　　B為縱向擴散系數(shù)。為減小縱向擴散可采用較高的載氣流速;或選擇分子量大的重載氣;也可降低柱溫。

　　C為傳質阻抗系數(shù)。在能完全覆蓋載體表面的前提下，應適當減少固定液用量。

　　范氏方程說明填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、載氣流速、柱溫、固定液層厚度對柱效的影響。

　　(二)氣相色譜儀

　　1.氣源：FID常用載氣多為氮氣或氦氣;TCD多用氦氣或氫氣為載氣;ECD多用氮氣或氬氣

　　2.進樣及汽化系統(tǒng)

　　3.色譜柱和柱溫箱

　　4.檢測器

　　熱導檢測器TCD：濃度型檢測器。構造簡單、測定范圍廣、樣品不破壞，但靈敏度較低。

　　電子捕獲檢測器ECD：靈敏度高、選擇性好。對無電負性基團的化合物響應低。

　　氫離子火焰檢測器FID：質量型檢測器。靈敏度高、響應快、線性范圍寬，最常用。

　　(三) 應用 1.鑒別：利用保留值進行鑒別。

　　2.檢查

　　(1) 內(nèi)標法加校正因子測定供試品中某個雜質含量

　　(2) 外標法測定供試品中某個雜質或主成分含量

　　(3) 加校正因子的主成分自身對照法

　　(4) 不加校正因子的主成分自身對照法

　　(5) 面積歸一化法：一般不用于微量雜質檢查

　　3.含量測定：外標法，內(nèi)標法

　　內(nèi)標物要求：①原樣品中不含有的組分;②保留時間與待測組分相近，但能完全分離;③純度合乎要求。

　　二、高效液相色譜法

　　(一)速率理論：高效液相色譜法中影響柱效主要因素為渦流擴散項和傳質阻抗項。由于液體黏度比載氣大得多，而且柱溫多為室溫，其縱向擴散項很小，可忽略不計。范氏方程簡化為 H=A +Cμ

　　(二) 高效液相色譜儀： 1.高壓輸液泵 2.色譜柱：分析型和制備型 3.進樣閥 4.檢測器：①固定波長檢測器;②可變波長檢測器;③光二極管陣列檢測器

　　(三)應用：與氣相色譜法相似

　　三、色譜系統(tǒng)適用性試驗方法

　　1.理論塔板數(shù)：不得低于各品種項下規(guī)定的最小理論塔板數(shù)

　　2.分離度：除另有規(guī)定外，分離度應大于1.5

　　3.重復性：取各品種項下對照品2連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標準偏差不大于2.0%

　　4.拖尾因子：除另有規(guī)定外，拖尾因子應在0.95～1.05之間

　　第三節(jié) 電泳法

　　熟悉電泳法的基本原理和常用的電泳方法。

　　了解毛細管電泳法的基本原理。

　　一、基本原理

　　電泳遷移速度 ν=μE

　　在相同電場強度下，兩組分分離程度取決于二者淌度之差。電泳分離后各組分的相對位置由組分的電泳泳動和緩沖液電滲共同決定。

　　影響電泳分離的條件包括：

　　1.緩沖液的pH值和離子強度：pH直接影響組分的荷電情況，是電泳分離的最重要條件。離子強度太小則緩沖容量不足，區(qū)帶易擴散;太大則組分移動慢，發(fā)熱嚴重。

　　2.電場強度：電場強度越大分離越完全，大于20V/cm時發(fā)熱嚴重。

　　3.樣品濃度：通常以1%為宜。太濃拖尾，太稀測定結構精密度差。

　　二、各類電泳法

　　1.紙電泳法 2.醋酸纖維素電泳法 3.瓊酯糖凝膠電泳法 4.聚丙烯酰胺凝膠電泳法 5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法

　　三、毛細管電泳法

　　以彈性石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，依照樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)分離的方法。

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